超低分子量蛋白Marker V（3.5-42
kD）（非預(yù)染）
Ultra Low Molecular Weight Protein Marker V（3.5-42 kD）
Ver.
750271-2.0
RTD6113 20次（100 μl）
● 貯存、運(yùn)輸及效期：
-20℃保存；濕冰運(yùn)輸；有效期1年。
● 貯存緩沖液成分：
65 mM Tris-HCl (pH 7.0), 20%
Glycerol, 還原劑, 2% SDS, 0.005% 溴酚藍(lán)。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
本產(chǎn)品包含8種低分子量蛋白質(zhì)，分子量范圍為3.5-42 kD，通過(guò) Tris-Tricine-SDS-PAGE電泳并經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后可見(jiàn)分子量大小為3.5，4.5，8.5，14.4，17，21，30，42
kD的條帶。
以每次上樣5 μl計(jì)算，該產(chǎn)品可以使用20次。
|
技術(shù)規(guī)格
|
|
條帶數(shù)量
|
8條
|
|
濃度
|
0.1-0.3 μg/μl
|
|
上樣前處理
|
95-100℃加熱處理5
min
|
|
推薦凝膠體系
|
16.5%或18%Tris-Tricine-SDS-PAGE
|
|
推薦上樣體積
|
3-5 μl（1mm厚度10齒梳子）
|
|
推薦染色方法
|
非預(yù)染Marker，電泳時(shí)不可見(jiàn)條帶，電泳后需要考馬斯亮藍(lán)染色可以觀察條帶
|
|
不適用于非變性電泳
|
為變性Marker，不適用于非變性電泳
|
● 使用說(shuō)明：
1. 第一次收到該產(chǎn)品，常溫融化后，徹底混勻，離心快甩10
Sec將溶液完全收集到管底，-20℃貯存；
2. 使用該產(chǎn)品時(shí)，常溫解凍后輕輕混勻或用移液槍緩慢吹打均勻；
3. 從原液中吸取所需的上樣量至新的微量離心管中；
4. 95-100°C下加熱
5 min，使蛋白質(zhì)完全變性；
5. 低速離心快甩10 Sec后，取 3-5 μl上樣電泳；
一. 制膠：
多肽電泳建議使用Tris-Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)來(lái)分離蛋白，該系統(tǒng)可以分離1-100 kD的蛋白質(zhì)（最優(yōu)分離2.5-30 kD）?？蛻艨梢允褂肨ris-Tricine-SDS-PAGE凝膠快速制備及電泳試劑盒
（含預(yù)染Marker）（貨號(hào)：RTD6121）或Tris-Tricine-PAGE凝膠制備及電泳試劑盒（多肽變性電泳）（貨號(hào)：RTD6122）進(jìn)行Tricine電泳，方便快捷?；蛘吒鶕?jù)以下程序制備凝膠，先配制分離膠，聚合后再配制夾層膠，最后配制濃縮膠，3種膠的制膠體積比約為4.5:1.5:1.5。
1.1 配制分離膠：
1.1.1 按照表一將不同體積的分離膠組份加入到小燒杯中混合。
表一
（一塊1 mm 厚度小板膠用量）
|
|
分離膠
|
夾層膠
|
濃縮膠
|
|
|
16.5%T6%C/4.5
ml
|
10%T3%C/2
ml
|
5%T3%C/2
ml
|
|
49.5%T
3%C
|
/
|
0.4
ml
|
0.2
ml
|
|
49.5%T
6%C
|
1.5
ml
|
/
|
/
|
|
4×凝膠緩沖液
|
1.125
ml
|
0.5
ml
|
0.5
ml
|
|
50%甘油（v/v）
|
0.9
ml
|
-
|
-
|
|
蒸餾水
|
0.95
ml
|
1.1
ml
|
1.3
ml
|
|
10%APS
|
~45
μl
|
~20
μl
|
~20
μl
|
|
TEMED
|
~4.5
μl
|
~2
μl
|
~2
μl
|
注：如非必須，不要使用1.5mm厚度的凝膠，這樣會(huì)減少電泳后染色和脫色的時(shí)間。
1.1.2 加入10%APS和TEMED，立即混勻以使溶液混勻。
1.1.3 在玻璃板中灌入分離膠溶液，然后輕輕覆蓋一層1-3 cm的無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。
1.1.4 靜置10-20分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。分離膠37℃約10分鐘，25℃約15分鐘，18℃ 約20分鐘可以聚合。
1.2 配制夾層膠：
1.2.1 去除覆蓋在分離膠上的醇，用濾紙將殘留的醇吸去。
1.2.2 按照表一將不同體積的夾層膠組份加入到小燒杯中混合。
1.2.3 加入10%APS和TEMED，立即混勻使溶液混勻。
1.2.4 在玻璃板中灌入適量夾層膠溶液，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長(zhǎng)0.5
cm即可，然后在溶液上輕輕覆蓋一層1-3cm的無(wú)水乙醇，使凝膠表面保持平整。注：此溶液為過(guò)量，請(qǐng)勿全部注入。
1.2.5 靜置20-30分鐘，待夾層膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。夾層膠37℃ 20分鐘，25℃ 25分鐘，18℃ 約30分鐘可以聚合。
1.3 配制濃縮膠
1.3.1 去除覆蓋在夾層膠上的乙醇，用濾紙將殘留的醇吸去。
1.3.2 按照表一將不同體積的濃縮膠組份加入到小燒杯中混合。
1.3.3 加入10%APS和TEMED，立即混勻，以使溶液充分混勻。
1.3.4 將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
1.3.5 靜置20-40分鐘裝待凝膠聚合。注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。濃縮膠37℃ 20分鐘，25℃ 30分鐘，18℃ 40分鐘可以聚合。
二. 電泳：
2.1 電泳緩沖液配制：
電泳前，將10×陽(yáng)極緩沖液（Cat No:AB080）和10×陰極緩沖液（Cat No:CB010）用蒸餾水稀釋成1×緩沖液備用。
2.2 樣品處理：
待上樣的檢測(cè)樣品與2×Tricine上樣緩沖液(Cat:TP050)等體積混合，95℃處理5分鐘后上樣。蛋白Marker一般已經(jīng)含有上樣緩沖液，預(yù)染Marker不能加熱處理，混勻后直接上樣，非預(yù)染Marker一般需要95℃處理5 min后上樣。
2.3 電泳：
將電泳槽的外槽加入1×陽(yáng)極緩沖液，內(nèi)槽加入1×陰極緩沖液，輕柔拔出梳子，將Marker或蛋白樣品加入點(diǎn)樣孔，穩(wěn)壓電泳（電泳條件參考下表）
|
|
電壓
|
電流變化
|
電泳時(shí)間
|
|
濃縮膠
|
恒壓30 V
|
起始電流：~ 15 mA
終止電流：~ 10 mA
|
~40
min
|
|
|
|
注：等待樣品指示前沿到達(dá)夾層膠上沿時(shí)，調(diào)高電壓
|
|
|
夾層膠
|
恒壓80 V
|
起始電流：~ 35 mA
終止電流：~ 30 mA
|
~60
min
|
|
|
|
注：等待樣品指示前沿到達(dá)分離膠上沿時(shí)，調(diào)高電壓
|
|
|
分離膠
|
恒壓120 V
|
起始電流：~ 40 mA
終止電流：~ 20 mA
|
~100
min
|
|
待指示前沿到達(dá)分離膠下沿時(shí),即可停止電泳，電泳時(shí)間總計(jì)約200
min。
注：恒壓條件下，電流不可調(diào)節(jié)，電流是逐漸降低的，觀察記錄電流數(shù)值。
|
三. 凝膠檢測(cè)：
3.1 凝膠染色（FastBlue蛋白染色液）：
3.1.1將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中,用適量蒸餾水漂洗，去除膠表面的SDS，殘余SDS會(huì)導(dǎo)致染色液出現(xiàn)沉淀。
3.1.2 棄水，加入適量染色液（以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適)，搖床上常溫?fù)u動(dòng)，根據(jù)下表確定染色時(shí)間。
|
待檢測(cè)蛋白量
|
染色時(shí)間
|
|
＞1 μg
|
~5分鐘
|
|
100 ng-1
μg
|
~10分鐘
|
|
10 ng-100
ng
|
~60分鐘
|
3. 1.3 搖床上搖動(dòng)至所有條帶清晰可見(jiàn)。
3.
1.4 蒸餾水搖動(dòng)漂洗脫色1-2次，每次5-10分鐘，至凝膠背景干凈。
3. 1.5 收集用過(guò)的染色液，可以重復(fù)使用2-3次。
凝膠也可以使用常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液（配方7）和脫色液（配方8）進(jìn)行染色和觀察。需要注意的是，常規(guī)染色和脫色方法需要較長(zhǎng)時(shí)間，小肽由于長(zhǎng)度較短，和凝膠結(jié)合不緊密，長(zhǎng)時(shí)間在溶液中浸泡容易從凝膠中脫離。FastBlue蛋白染色液（貨號(hào)：RTD6202）除具有染色快，無(wú)毒，靈敏性高等特點(diǎn)外，還能對(duì)小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。
3.2 轉(zhuǎn)膜：
多肽電泳后轉(zhuǎn)膜選擇孔徑0.22 μm PVDF膜（用前用甲醇處理潤(rùn)濕）或0.22
μm NC膜。
3.2.1
半干轉(zhuǎn)：使用伯樂(lè)Trans-Blot Turbo半干轉(zhuǎn)機(jī)器請(qǐng)選擇配套的5×RealBlot快速半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：RT5030），推薦轉(zhuǎn)膜條件:一板小型凝膠(8×10
cm)恒流,1.3 A,10-15 min。
3.2.1
濕轉(zhuǎn)：濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜緩沖液(25 mM Tris,192 mM Glycine, 0.01%SDS，20%
Methanol,pH~8.3），可以選擇10×Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：TB1040）。推薦轉(zhuǎn)膜條件：恒流200
mA 40-60 min。
四.小分子蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳試劑配制：
實(shí)驗(yàn)示例：
